Биотический стресс

Классификация стрессовых факторов, оказывающих влияние на виноградное растение

КЛАССИФИКАЦИЯ СТРЕССОВЫХ ФАКТОРОВ,
ОКАЗЫВАЮЩИХ ВЛИЯНИЕ НА ВИНОГРАДНОЕ РАСТЕНИЕ

А.Ф. Хисамутдинов, канд. с.-х. наук
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт
виноградарства и виноделия им. Я.И Потапенко Россельхозакадемии

Актуальность направления. Стресс – это состояние напряжения, возникающее у живого организма под влиянием сильных воздействий. При любом воздействии различных экстремальных факторов (стрессоров) в организме возникают однотипные биохимические изменения, направленные на преодоление действия этих факторов путем адаптации организма к предъявленным требованиям. Выраженность этих изменений зависит от интенсивности предъявляемых требований и от функционального состояния физиологической системы. Без некоторого уровня стресса никакая активная деятельность невозможна, и полная свобода от стресса, по утверждению Ганса Селье [1], равнозначна смерти. Поэтому стресс может быть не только вреден, но и полезен для организма (эустресс), он мобилизует его возможности, повышает устойчивость к отрицательным воздействиям. Вредный стресс (дистресс), напротив, снижает сопротивляемость организма, вызывает возникновение и ухудшение течения различных заболеваний. Селье полагал, что болезни, возникающие вследствие стресса, обусловлены либо чрезмерной интенсивностью, либо неадекватной реакцией гормональной системы на действие стрессора. Иногда дистресс возникает даже при низком уровне воздействий стрессоров. Природа различий эустресса и дистресса во многом неясна. Большое значение для характера последствий действия стресса имеют поведенческие реакции на стрессовую ситуацию.
Таким образом, можно говорить, что виноградное растение – как живой организм – также подвержено действию различных стрессоров, которые могут вызывать как положительные, так и отрицательные реакции. Необходимо изучать природу дистрессовых явлений и их влияние на состояние виноградного растения и качество вина. В первую очередь, это повреждения морозами и заморозками, негативное воздействие повышенных температур и дефицит почвенной влаги, сильные ветра и суховеи, а также различные антропогенные нагрузки.
В настоящее время в мире уделяется большое внимание качеству выпускаемой винодельческой продукции, которое складывается из целого ряда показателей. Так, по некоторым данным [2], виноградные растения, подвергшиеся воздействию стрессоров, дают урожай, вино из которого проявляет нетипичные признаки старения (НПС). Причем НПС потенциально возникают только в молодом вине и могут быть определены с помощью специального теста. При этом было установлено, что НПС вызываются не техническими или технологическими мероприятиями, а только непосредственно самой лозой. Поэтому наши исследования посвящены изучению природы стрессовых явлений и их влиянию на продуктивность виноградных насаждений и качество вина.
Перед нами была поставлена задача – на основе литературных данных, изучить возможные на виноградниках стрессовые явления и классифицировать их.
Первоначально факторы, влияющие на виноград, можно разделить на четыре категории: абиотические, биотические, агротехнические и техногенные.

1. Абиотические стрессовые факторы.

Под абиотическими факторами понимают ту часть неживой природы, которая в той или иной степени является неотъемлемой частью процессов жизни организма. Это свет, тепло, воздух, влага различного происхождения, почва с совокупностью ее физико-химических свойств, тип рельефа.
Влияние этих факторов на живой организм разнообразно. Диапазон их действия ограничен точками максимума и минимума, при которых возможно существование растения. Наиболее благоприятное развитие организм получает в зоне оптимума.
Условия среды, в которых какой-либо фактор приближается к пределам этой зоны и начинает оказывать угнетающее действие, определяются как экстремальные.
Виноград относят к влаголюбивым мезофитам. Для нормального произрастания неорошаемых виноградных растений минимальное годовое количество осадков должно составлять 400-500 мм. Обеспеченность влагой ниже этих пределов, особенно в сочетании с воздушной засухой и с высокой температурой, вызывает различной степени нарушения метаболизма, роста и продуктивности виноградных растений.
Внешние признаки повреждения кустов винограда засухой: замедление роста побегов, изменение окраски и состояние упругости верхушечных побегов, усыхание верхних усиков, листья приобретают тусклый серо-зеленый цвет, усыхание верхушек побегов и близко расположенных листьев, пожелтение, подсыхание и опадение нижних листьев [3,4,5].
Для оптимального развития винограда необходимо длинное, и теплое лето, и умеренно холодная зима. Виноградные растения чувствительны к отрицательным температурам. Повреждения, причиненные морозами, резко сокращают урожайность, а иногда приводят к полной гибели виноградника. Кроме того, кусты сильно повреждаются осенними и весенними заморозками, а также относительно небольшими зимними морозами, наступающими после оттепели. Об этом свидетельствуют колебания продуктивности и качества урожая по годам, а также наличие экологических ниш, в которых наблюдается большая долговечность насаждений, исключительно высокая продуктивность и качество урожая отдельных сортов [6].
Кроме того, сильнейшим стрессором, воздействующим на растения, является резкое понижение температуры в вегетационный период. На молекулярном уровне показано, что при экспериментальных низкотемпературных воздействиях растения замедляют свой обмен и переживают этот опасный период в заторможенном состоянии. Установлен длительный характер холодного стресса [7].
Таким образом, действие на растение низких или высоких температур приводит к нарушению жизненных процессов. С точки зрения жаро-, холодо-, и морозоустойчивости предложено весь диапазон температур, действующих на активно вегетирующие растения, разделить на 5 зон: фоновую, две закаливающие (адаптационные) и две повреждающие (в области высоких и низких температур).
Большой теоретический и практический интерес представляет изучение стрессовых реакций растительного организма на действие вредных солей, содержащихся в почве.
Наличие в почве солей сверх 0,4% (от сухого веса почвы) вызывает угнетение виноградных кустов и резкое снижение их урожайности.
Условия засоления оказывают большое влияние на ход физиолого-биохимических процессов в организме растений – на азотистый и углеводный обмен, на активность ферментов, на фотосинтез, на транспирацию и т.д., а также на анатомо-морфологическую структуру тканей.
Солевое отравление возникает не вследствие непосредственного токсического действия солей, как таковых, а в результате накопления в тканях ядовитых продуктов обмена [8].
Одной из основных защитно-приспособительных реакций растений на вредное воздействие солей является связывание ионов органическими веществами. Благодаря тому, что виноградное растение обладает свойством задерживать соли в тканях листьев, другие органы не подвергаются вредному воздействию солей. Ценою массовой потери соленасыщенных листьев достигается сохранение жизнедеятельности всего организма.
Внешние признаки солеугнетения виноградного куста, по описанию Г.З. Березенко, выражаются в форме опадения верхушек основных и пасынковых побегов, высыхания и опадения усиков, в приобретении листьями желтоватой окраски, а также ломкости листовых пластинок.
По некоторым данным [8], в условиях почвенного засоления изменяется интенсивность некоторых биохимических процессов, протекающих в ягодах винограда – усиливаются темпы сахаронакопления и устанавливается иное количественное соотношение сахаров в ранних фазах созревания ягод. Сахаристость их повышается в основном за счет фруктозы и сахарозы. Это рассматривается как своеобразная защитно-приспособительная реакция виноградного растения против вредного действия солей.
Кроме вышеперечисленных почвенно-климатических факторов, влияющих на виноградное растение, существуют и некоторые другие.
Так, В.А. Бондарев и Г.Н. Теренько [9] пишут, что ветер оказывает существенное влияние на плодовые сады Северо-Кавказского региона. Наиболее опасен весенний сухой восточный или юго-восточный ветер («астраханец»), так как приходится на период цветения плодовых пород. Следует сказать, что ветер значительно усиливает действие пониженных или повышенных температур.
К стрессовым ситуациям также относится повреждение виноградников градом. В результате в значительной степени могут повреждаться кора и листья.

2. Биотические стрессовые факторы.

Одним из важнейших биотических показателей садовых агроценозов является структура и динамика патосистем, от которых зависит долговременность устойчивости растений к стрессорам различного происхождения.
Биотические факторы подразделяют по источникам влияния на: микробно- и микогенные (болезни), зоогенные (вредители) и фитогенные (сорняки).
Многочисленные исследования по вопросу о влиянии болезней винограда на качество и типичность вин привели к выводу, что из поврежденных гниением ягод невозможно получить полноценную продукцию. Это объясняется, прежде всего, тем, что в этом случае происходит резкое уменьшение содержания дубильных веществ и в кожице, и в гребнях. Наблюдается снижение содержания ароматических веществ, что лишает вино типичного букета. Значительно понижается содержание фенолов [10].
П.Г. Катарьян и И.Н. Хилькевич [11] приводят результаты, показывающие, что к моменту уборки урожая сорта Мускат белый при поражении листьев винограда милдью на 50 %, содержание сахаров в его ягодах снизилось до 15,6 г/100 см 3 . При поражении на 90 % — до 12,7 г/100 см 3 против 17,5 г/100 см 3 у кустов, имевших поражение листьев до 20 %.
Анализируя влияние различных условий на качество продукции, Н.Т. Паныч [10] пишет, что при высокой урожайности всегда недостает какого-либо фактора для получения высококачественного продукта. Чем выше урожай, тем больше времени требуется для доведения его до необходимой кондиции. Растянутое созревание приводит к поздним сборам в ненастный период. Наблюдается массовое загнивание урожая. Отсюда ухудшение качества конечной продукции.
Сорные растения являются неотъемлемым компонентом природных и антропогенных биоценозов и очень тесно связаны с возделываемыми культурами. Сорняки распространены во всех зонах возделывания винограда. Встречается от 25 весной до 35 летом видов сорных растений.
По данным В.П. Поповой [12], мировые потери урожая плодовых культур (в том числе винограда) составляют 17 % потенциального урожая. Это, прежде всего, связано с тем, что сорные растения способны конкурировать с культурными за влагу и питательные вещества, ухудшая тем самым рост и развитие последних. Установлено, что в условиях Краснодарского края сорные растения способны развивать в течение одного вегетационного периода до 350-600 ц/га зеленой массы. Для создания такой биомассы травы потребляют 3800-3900 т/га воды, 114-120 кг/га азота, 30-35 кг/га фосфора и 160-180 кг/га калия.
Однако не до конца ясно, следует ли приравнивать сорную растительность и связанные с ней процессы к стрессорам.
Многолетнее изучение агросистем позволило установить неразрывность влияния биотических и абиотических факторов на состояние виноградников и выделить их биоэкологические особенности, определить тенденции изменчивости. В сформировавшихся виноградных агроценозах доминирующая роль в регулировании количества и качества урожая принадлежит биологическим объектам – возбудителям болезней и вредителям, а также тесно связанным с живыми организмами абиотическим факторам. Основными из которых являются погодные условия.

3 Агротехнические стрессовые факторы.

Как уже было сказано ранее, под понятием «стресс» подразумевают совокупность всех неспецифических изменений, возникающих под влиянием любых сильных воздействий и сопровождающихся перестройкой защитных систем организма. Назначение стресса состоит в том, чтобы адаптировать организм к вновь возникшим условиям среды. Он включает три стадии, проявляющееся во времени – раздражение, адаптация, истощение [1].
Среди факторов, обеспечивающих нормальное развитие и высокую урожайность винограда, большая роль отводится агротехнике. Все растения могут максимально проявить свойственную им продуктивность только при условии применения на виноградниках такой системы агротехнических мероприятий, которая при взаимодействии с экологическими факторами определенного географического района отвечала бы всем их требованиям к условиям выращивания. При низком уровне, независимо от степени благоприятствования других факторов, урожаи растений всегда будут низкими и невысокого качества.
Из множества агротехнических факторов наиболее существенными для винограда являются подрезка и нагрузка кустов побегами и урожаем. При выходе за оптимальные рамки указанные факторы выступают в роли стрессоров. В растении происходят значительные биохимические изменения, направленные на поддержание жизнеспособности организма. При этом значительно ухудшается качество урожая и вина [13,14,15,16,17].
Кроме того, ряд авторов пишут, что вследствие применения ко всем сортам стандартных приемов (длинной подрезки и повышенной нагрузки кустов) на многих виноградниках наблюдали периодичность плодоношения, а сок ягод при высокой урожайности характеризовался низкой сахаристостью [15].
Известно, что зеленые операции могут значительно улучшать качество винограда. Однако имеются данные, указывающие на противоположный эффект. Так, О.П. Рябчун и Р.Т. Рябчун [18,19], подводя итоги 11-летнего опыта с многократной чеканкой на высоте 100 см, пишут, что в отношении сорта Кумшацкий она совершенно недопустима, а у сортов Шасла белая, Алиготе и Рислинг рейнский не отражается существенно на плодоношении. При дальнейшем усилении жесткости и снижении уровня чеканки до 75 см проявляется ее выраженное отрицательное действие.
П.Г. Катарьян и И.Н. Хилькевич [20] приводят данные, показывающие влияние различной глубины чеканки побегов на сахаристость винограда сорта Мускат белый. Из результатов видно, что применение глубокой чеканки резко снижает содержание сахаров в соке ягод. Разница по содержанию сахаров в сусле на период уборки достигает 2,5 г/100 см 3 .
Анализ литературных источников показал, что, кроме перечисленных факторов, на качество вина могут влиять и другие (схема посадки, форма куста, подвой, внесение удобрений, искусственное орошение и др.). Вероятно, что при определенных условиях они могут вызывать стресс у виноградного растения и являться для него стрессором.

4 Техногенные стрессовые факторы

В данную группу факторов в первую очередь входят деятельность крупных промышленных объектов и близость автомагистралей, наличие которых приводит к загрязнению окружающей среды соединениями серы, азота, тяжелыми металлами и др. Отмечается, что усиление техногенного загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами вызывает необходимость изучения их влияния на растения в первую очередь [21,22,23,24,25,26].
Кроме того, считаем, что в данную категорию стрессовых факторов следует отнести загрязнение почв гербицидами и пестицидами, а также различные повреждения растений сельскохозяйственными машинами и механизмами.
Однако следует сказать, что, несмотря на малую изученность указанных факторов, они представляются как стрессоры. Поэтому считаем, что при составлении классификации стрессовых явлений на виноградниках их необходимо учитывать.
Таким образом, исходя из представленного обзора, можно говорить, что стрессом виноградного растения является – неспецифическая реакция растительного организма, вызванная резким изменением внешних факторов. Факторы, вызывающие эти изменения называются стрессорами.
Классификация стрессоров, воздействующих на виноградное растение, может иметь следующий вид.
Следует сказать, что представленная классификация не является окончательной и безупречной. Возможно, также, что в дальнейшем данная структурная схема будет видоизменяться и дополняться новыми факторами и критериями.

СТРЕССОРЫ

Абиотические
Температурный фактор

vinograd.info

Влияние биотического стресса на активность различных форм аденилатциклазы в органеллах клеток растений картофеля Текст научной статьи по специальности «Биология»

Аннотация научной статьи по биологии, автор научной работы — Ломоватская Л. А., Романенко А. С., Криволапова Н. В., Копытчук В. Н.

Поступила в редакцию 17 апреля 2006 г. Несмотря на значительный интерес, проявляемый к изучению аденилатциклазной сигнальной системы растений, нет полного представления о функционировании и механизмах регуляции данной сигнальной системы у растений при биотическом стрессе. В связи с этим в задачу настоящего исследования входило выявление различных форм аденилатциклазы (трансмембранной и «растворимой») в ядре и хлоропластах клеток картофеля и модулирование их активности под воздействием экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили картофеля . Проведенные исследования позволили установить, что в ядрах и хлоропластах клеток растений картофеля функционируют две формы аденилатциклазы: трансмембранная и «растворимая». Активность данных форм фермента, выделенных из клеток растений двух сортов картофеля , контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, менялась противоположным образом при опосредованном воздействии экзополисахаридов, секретируемых вирулентным и мукоидным штаммом бактериального возбудителя: у растений устойчивого сорта возрастала, восприимчивого угнеталась. Сделан вывод о том, что активность обеих форм аденилатциклазы прямо зависит от степени устойчивости сорта картофеля к данному патогену

Похожие темы научных работ по биологии , автор научной работы — Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В., Копытчук В.Н,

BIOTIC STRESS IMPACT ON ACTIVITY OF VARIOUS FORMS OF ADENYLATE CYCLASE IN ORGANELLES OF POTATO PLANT

Notwithstanding significant interest towards study of adenylate cyclase plant signal system, there is still no complete picture of functioning and regulation mechanisms of this signal system in plants under biotic stress. With this in view, our study was aimed at identification of various forms of adenylate cyclase (transmembrane and «soluble») in the nucleus and chloroplasts of potato cells and modulation of their activity under the impact of exopolysacchandes of potato ring rot pathogen. The investigations conducted allowed to conclude that two forms of adenylate cyclase function in nuclei and chloroplasts of potato plants: transmembrane and «soluble». Activity of these forms of the enzyme extracted from plant cells of the two potato varieties contrasted by resistance to potato ring rot pathogen Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, changed in the reverse manner with the mediated impact of exopolysaccharides secreted by virulent and mucinous strain of bacterial pathogen: in the plants of resistant cultivar it increased, in the plants of sensitive cultivar it was oppressed. It was concluded that activity of both forms of adenylate cyclase directly depended on the degree of resistance of a particular potato variety to given pathogen

Текст научной работы на тему «Влияние биотического стресса на активность различных форм аденилатциклазы в органеллах клеток растений картофеля»

Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 2, No. 2, 2006, pp. 10-16.

Original Text Copyright © 2006 by Lomovatskaya, Romanenko, Krivolapova, Kopytchuk

BIOTIC STRESS IMPACT ON ACTIVITY OF VARIOUS FORMS OF ADENYLATE CYCLASE IN ORGANELLES OF POTATO PLANT CELLS

Lomovatskaya L.A., Romanenko A. S., Krivolapova N.V., Kopytchuk V.N.

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SD RAS,. 664033 Irkutsk p/b 317

Received April 17, 2006

Abstract — Notwithstanding significant interest towards study of adenylate cyclase plant signal system, there is still no complete picture of functioning and regulation mechanisms of this signal system in plants under biotic stress. With this in view, our study was aimed at identification of various forms of adenylate cyclase (transmembrane and “soluble”) in the nucleus and chloroplasts of potato cells and modulation of their activity under the impact of exopolysaccharides of potato ring rot pathogen. The investigations conducted allowed to conclude that two forms of adenylate cyclase function in nuclei and chloroplasts of potato plants: transmembrane and “soluble”. Activity of these forms of the enzyme extracted from plant cells of the two potato varieties contrasted by resistance to potato ring rot pathogen Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, changed in the reverse manner with the mediated impact of exopolysaccharides secreted by virulent and mucinous strain of bacterial pathogen: in the plants of resistant cultivar it increased, in the plants of sensitive cultivar it was oppressed. It was concluded that activity of both forms of adenylate cyclase directly depended on the degree of resistance of a particular potato variety to given pathogen.

Key words: Potato /ring rot/adenylate cyclase “soluble”/adenylate cyclase transmembrane /resistance

ВЛИЯНИЕ БИОТИЧЕСКОГО СТРЕССА НА АКТИВНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ В ОРГАНЕЛЛАХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ

Ломоватская J1.A., Романенко А.С., Криволапова Н.В., Копытчук В.Н.

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск, 664033, ул. Лермонтова, 132, а/я 317

Поступила в редакцию 17 апреля 2006 г.

Несмотря на значительный интерес, проявляемый к изучению аденилатциклазной сигнальной системы растений, нет полного представления о функционировании и механизмах регуляции данной сигнальной системы у растений при биотическом стрессе.

В связи с этим в задачу настоящего исследования входило выявление различных форм аденилатциклазы (трансмембранной и «растворимой») в ядре и хлоропластах клеток картофеля и модулирование их активности под воздействием экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили картофеля. Проведенные исследования позволили установить, что в ядрах и хлоропластах клеток растений картофеля функционируют две формы аденилатциклазы: трансмембранная и “растворимая”. Активность данных форм фермента, выделенных из клеток растений двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, менялась противоположным образом при опосредованном воздействии экзополисахаридов, секретируемых вирулентным и мукоидным штаммом бактериального возбудителя: у растений устойчивого сорта возрастала, восприимчивого

— угнеталась. Сделан вывод о том, что активность обеих форм аденилатциклазы прямо зависит от степени устойчивости сорта картофеля к данному патогену..

Key words: Картофель /кольцевая гниль/ аденилатциклаза «растворимая» / аденилатциклаза трансмембранная / устойчивость

Растительные организмы в природных условиях часто подвергаются воздействию неблагоприятных факторов внешней среды как абиотической так и биотической природы. В результате у растений развиваются первичные защитные механизмы, интенсивность которых в значительной степени зависит от активности путей сигнальной индукции. Одним из таких путей является аденилатциклазная сигнальная система. Несмотря на накопленные сведения, касающиеся функционирования такого сигналинга в разных условиях (Carricarte et al, 1988; Cooke et al., 1994; Bundschedler et al., 2001), нет полного представления о внутриклеточной компартментации и механизмах регуляции активности аденилатциклазной сигнальной системы у растений. До недавнего времени считалось, что аденилатциклаза (АЦ)

локализуется только на плазматической мембране, поскольку ее активность регулируется соответствующими G-белками, связанными с рецептором, воспринимающим сигнал из окружающий среды (Sunahara, Taussig, 2002). Но исследования последних лет, проведенные на животных объектах, позволили обнаружить и другую форму этого фермента — так называемую растворимую аденилатциклазу (рАЦ) (Zippin et al., 2004).

Она была выявлена в ядрах и митохондриях клеток животных и ее активность не зависела от типичных активаторов трансмембранной аденилатциклазы (тмАЦ) — ГТФ, форсколина и фторида натрия (Zippin et al., 2004). Авторы объясняют присутствие такой формы АЦ необходимостью оперативной трансдукции сигнала в генетический аппарат клетки,

поскольку цАМФ — продукт реакции тмАЦ, быстро утилизируется вблизи от места его синтеза ( Rich et al., 2001; Zippin et al., 2004). По имеющимся сведениям, у растений активность аденилатциклазы выявлялась в мембранах ядер и хлоропластов (Witters et al., 2005), но не обсуждается, к какому типу АЦ относилась обнаруженная активность.

Для картофеля одним из биогенных стрессовых факторов является бактериальный возбудитель кольцевой гнили Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieck. et Kott.) Skaptason et Burkh, (Cms). Ранее было установлено, что инициация данного бактериоза происходит также по принципу лиганд-рецепторного взаимодействия. Со стороны Cms в этом процессе, в числе других факторов патогенности, участвуют экзополисахариды (ЭПС), а со стороны растений картофеля -рецепторы к ЭПС, локализованные в клеточных стенках и на плазмалемме (Романенко и др., 1999; Шафикова др., 2003). Было показано, что устойчивость сорта обратно пропорциональна количеству данных рецепторов: у

восприимчивого сорта их примерно на порядок больше, чем у резистентного (Романенко и др.,

1999). Тем не менее, пути трансдукции сигнала, в частности, с участием аденилатциклазной системы при биотических стрессах у растений, включая картофель, изучены явно недостаточно.

В этой связи в данном исследовании было поставлено две задачи. Во-первых, выяснить, какие формы АЦ присутствуют в растительной клетке, в том числе в органеллах — носителях генетической информации — в ядре и хлоропластах. Во-вторых, установить, какова реакция различных форм этого фермента, выделенных из растений двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили, на биотический стресс, которым в данном случае являлись ЭПС возбудителя. Проведение такого эксперимента представлялось целесообразным, поскольку ранее было показано, что в зависимости от устойчивости сорта картофеля к Cms, его ЭПС могут оказывать как элиситорный, так и супрессорный эффект, в частности, на активность in vitro пероксидаз, участвующих в защитных реакциях (Граскова и др., 2004).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пробирочные растения картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к Cms (сорт Луговской — устойчивый и сорт Лукьяновский — восприимчивый к данному возбудителю), культивировали в течение 3-4 недель на жидкой среде Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962) с добавками витаминов и гормонов (Бутенко и др., 1984). Экзополисахариды вирулентного и мукоидного штамма 5369 возбудителя кольцевой гнили

картофеля из культурального фильтрата выделяли и очищали методом колоночной ионообменной хроматографии (Strobel, 1967).

Инкубацию растений с ЭПС Cms, добавленными к среде роста растений в конечной концентрации 0,1%, проводили в течение 1 мин. Контролем служили растения без внесения ЭПС в среду роста.

По окончании инкубации растения гомогенизировали на холоду в 50 мМ трис-НС1 буфере, pH 7,2 с добавлением 0,1мМ теофиллина и 1мМ дитиотреитола («Sigma», США). Гомогенат фильтровали через два слоя капрона, фильтрат наносили на градиент плотности сорбита («Реахим», Россия) состоящий из следующих слоев: 4 М, 2,5 М, 1,5 М, 0,75 М и центрифугировали при 600 g на холоду 30 мин. Определение чистоты фракций осуществляли путем подсчета соответствующих органелл в люминесцентном микроскопе МЛ-2АУ4.2 («Ломо», Россия): хлоропласты обладали

собственной ярко-красной флюоресценцией, а ядра, предварительно окрашенные 0,01% 4,6-диамидин-2-фенилиндолом (“Sigma”, США), имели голубоватое свечение. Чистота фракций, оцененная таким образом, составляла 80-85%. Далее, в каждую пробу добавляли 0,3% октилглюкопиранозида («Sigma, США) детергента для высвобождения «растворимой» формы аденилатциклазы, и центрифугировали 3 часа при 80000 g. Реакцию инициировали внесением растительного белка (100-150 мкг/г сырой массы) в 500 мкл инкубационной среды: 50 мМ трис-НС1, pH 7,2, 0,1 мМ теофиллин, 1мМ дитиотреитол, 0,5 мМ АТФ (“Sigma”, США), 3 мМ MgS04 («Реахим», Россия). В некоторые пробы из осадка и из супернатанта добавляли специфические эффекторы трансмембранной и «растворимой» форм АЦ: ЮмМ NaF («Реахим», Россия) для стимуляции тмАЦ (Sunahara, Taussig, 2002) а 3 мМ МпС12 («Реахим», Россия) или 20 мМ NaHC03 («Реахим», Россия) — для активации рАЦ (Zippin et al., 2004).

Пробы инкубировали при 32°С в течение 30 мин. Реакцию останавливали кипячением (3 мин) на водяной бане. Затем, для повышения специфичности иммунной реакции, образцы дополнительно очищали от присутствия других циклических нуклеотидов с помощью нейтральной окиси алюминия («Мегк”, Германия) (White, Zenser,1971).

Количество цАМФ определяли

иммуноферментным анализом (Lomovatskaya et al., 2005). Белок в растительной пробе определяли по методу Брэдфорд (Яворская, Калинин,1984). Эксперименты проводили в трех биологических и пяти аналитических повторностях. Результаты обрабатывали статистически с вычислением стандартной ошибки среднего (Брехман,1970).

Следует заметить, что в осадке выявлялась активность только тмАЦ. а в супернатанте -только рАЦ.

Трансмембранная и «растворимая» формы АД ядер клеток растений устойчивого сорта. Было установлено, что в контрольном варианте (без добавления ЭПС Ств в среду роста растений) активность тмАЦ, выявляемая в присутствии КаР, была в 3 раза ниже, чем «растворимой», определяемой с помощью МпС12 и КаНСО;, (Рис. 1 А). Уровни активности рАЦ под воздействием этих агентов были почти одинаковыми. После кратковременной инкубации (1 мин) корней растений картофеля с ЭПС (опыт), наблюдалось увеличение активности обеих форм АЦ со специфическими эффекторами в 4,5-7 раз, соответственно, причем наибольшая величина активации была получена в варианте с ЫаНСО;, (Рис. 1 А)

Трансмембранная и «растворимая» АЦ хлоропластов клеток растений устойчивого сорта. В контроле (без ЭПС) уровень активности рАЦ превышал таковую тмАЦ примерно в 1,3-2 раза в присутствии МпСЬ и ЫаНСО,. соответственно (рис.1 А). ЭПС СМИ в различной степени стимулировали как тмАЦ так и рАЦ

Хлоропластов. В максимальной степени — в 17 раз активировалась трансмембранная АЦ (эффектор №Р); уровень рАЦ в варианте с МпСЬ был выше относительно контроля в 9 раз, а при добавлении ЫаНСОз — в 3,5 раза (Рис.1 А).

Трансмембранная и «растворимая» АЦ ядер клеток растений восприимчивого сорта. Как видно из Рис. 1 Б, активности обеих форм АЦ между собой существенно не различались, но были значительно ниже, чем у устойчивого сорта

— в 10 и 23 раза, соответственно. ЭПС ингибировали активности обеих форм данного фермента, причем тмАЦ в 2 раза, рАЦ — в 1,2 раза в присутствии МпСЬ и в 1,6 раза при добавлении ХаНСО;.

Трансмембранная и «растворимая» АЦ хлоропластов клеток растений восприимчивого сорта. Активность тмАЦ в контроле (без ЭПС) была значительно — в 5 раз ниже, чем у растений устойчивого сорта, в то время как уровень активности растворимой формы АЦ соответствовал аналогичному показателю у устойчивого сорта (рис.1 А, Б). ЭПС, как и во фракции ядер, Значительно ингибировали активность обеих форм фермента — тмАЦ в 3,5 раза, рАЦ в присутствии двух типов эффекторов

— в 13-14 раз, соответственно (Рис.1 Б).

□ jSfff ■ШШШг ■НаНШЙ

хлоропласты- хлоропласты-контроль опыт

Свидетельство о регистрации СМИ Эл № ФС77-52970

cyberleninka.ru